IPTG (izopropil-β-D-tiyogalaktozid) se yon analòg substrat β-galaktozidaz, ki trè endiksib. Anba endiksyon IPTG a, endiktè a ka fòme yon konplèks ak pwoteyin represè a, konsa konformasyon pwoteyin represè a chanje, pou li pa ka konbine avèk jèn sib la, epi jèn sib la eksprime avèk efikasite. Donk, kijan pou detèmine konsantrasyon IPTG a pandan eksperyans lan? Èske pi gwo a pi bon?
Premyèman, ann konprann prensip endiksyon IPTG a: operon laktoz E. coli a (eleman) gen twa jèn estriktirèl, Z, Y, ak A, ki kode β-galaktozidaz, pèmeaz, ak asetiltransferaz, respektivman. lacZ idrolize laktoz an glikoz ak galaktoz, oubyen an alo-laktoz; lacY pèmèt laktoz ki nan anviwònman an pase nan manbràn selilè a epi antre nan selil la; lacA transfere gwoup asetil la soti nan asetil-CoA pou ale nan β-galaktozid, sa ki enplike retire efè toksik la. Anplis de sa, gen yon sekans operasyon O, yon sekans depa P ak yon jèn regilatè I. Kòd jèn I a se yon pwoteyin represè ki ka mare nan pozisyon O sekans operatè a, pou operon an (meta) repouse epi etenn. Genyen tou yon sit lyezon pou pwoteyin aktivatè jèn katabolik - sit lyezon CAP an amont sekans inisyasyon P a. Sekans P a, sekans O a ak sit lyezon CAP la ansanm konstitye rejyon regilatè operon lac la. Menm rejyon regilasyon an reglemante jèn kodaj twa anzim yo pou reyalize ekspresyon kowòdone pwodwi jèn yo.
Lè laktoz pa la, operon lac la (meta) a nan yon eta represyon. Nan moman sa a, represè lac ki eksprime pa sekans I a anba kontwòl sekans pwomotè PI a mare ak sekans O a, sa ki anpeche ARN polimeraz mare ak sekans P a epi li inibi inisyasyon transkripsyon an; lè laktoz prezan, operon lac la (meta) ka pwovoke. Nan sistèm operon sa a (meta), vrè endiktè a se pa laktoz li menm. Laktoz antre nan selil la epi li katalize pa β-galaktozidaz pou konvèti an alolaktoz. Lèt la, kòm yon molekil endiktè, mare ak pwoteyin represè a epi chanje konformasyon pwoteyin nan, sa ki mennen nan disosyasyon pwoteyin represè a ak sekans O a ak transkripsyon an. Izopropiltiyogalaktozid (IPTG) gen menm efè ak alolaktoz. Li se yon endiktè trè pwisan, ki pa metabolize pa bakteri epi ki trè estab, kidonk li lajman itilize nan laboratwa.
Kijan pou detèmine konsantrasyon IPTG optimal la? Pran E. coli kòm egzanp.
Yo te inokile souch E. coli BL21 jenetikman modifye a ki genyen pGEX rekombinan pozitif (CGRP/msCT) la nan yon medyòm likid LB ki genyen 50μg·mL-1 Amp, epi yo te kiltive l pandan tout lannwit nan 37°C. Yo te inokile kilti ki anwo a nan 10 boutèy 50mL medyòm likid LB fre ki genyen 50μg·mL-1 Amp nan yon rapò 1:100 pou kilti ekspansyon, epi lè valè OD600 la te 0.6~0.8, yo te ajoute IPTG nan konsantrasyon final la. Li se 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1. Apre endiksyon an nan menm tanperati a ak menm lè a, yo te pran 1 mL nan solisyon bakteri a, epi yo te kolekte selil bakteri yo pa santrifijasyon epi yo te sibi SDS-PAGE pou analize enfliyans diferan konsantrasyon IPTG sou ekspresyon pwoteyin, epi answit chwazi konsantrasyon IPTG ki gen pi gwo ekspresyon pwoteyin lan.
Apre eksperyans yo, yo pral jwenn ke konsantrasyon IPTG a pa osi gwo ke posib. Sa a se paske IPTG gen yon sèten toksisite pou bakteri yo. Depase konsantrasyon an ap touye selil la tou; epi anjeneral pale, nou espere ke plis pwoteyin idrosolubl ki eksprime nan selil la, se pi bon, men nan anpil ka lè konsantrasyon IPTG a twò wo, yon gwo kantite enklizyon ap fòme. Kò a, men kantite pwoteyin idrosolubl la diminye. Se poutèt sa, konsantrasyon IPTG ki pi apwopriye a souvan pa pi gwo a pi bon, men pi ba konsantrasyon an.
Objektif endiksyon ak kiltivasyon souch jenetikman modifye yo se ogmante sede pwoteyin sib la epi diminye depans yo. Ekspresyon jèn sib la pa sèlman afekte pa faktè pwòp souch la ak plasmid ekspresyon an, men tou pa lòt kondisyon ekstèn, tankou konsantrasyon endiktè a, tanperati endiksyon an ak tan endiksyon an. Se poutèt sa, an jeneral, anvan yo eksprime epi pirifye yon pwoteyin enkoni, li pi bon pou etidye tan endiksyon an, tanperati a ak konsantrasyon IPTG a pou yo ka chwazi kondisyon ki apwopriye yo epi jwenn pi bon rezilta eksperimantal yo.
Dat piblikasyon: 31 Desanm 2021